Balb/c裸鼠体内的干细胞致瘤实验

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.06.011

摘要/Abstract

摘要：

背景：干细胞致瘤性研究是临床应用干细胞安全性所面临的实际问题。因此明确干细胞是否具有致瘤性尤为重要。裸鼠在肿瘤学、免疫学、药品及生物制品的安全性评价领域占据愈来愈重要的地位。

目的：将神经干细胞、间充质干细胞移植在Balb/c免疫缺陷裸鼠皮下，检测其是否具有致瘤性。

方法：将免疫缺陷Balb/c裸鼠随机分为5组，除空白组外，阳性对照组、阴性对照组、神经干细胞组和间充质干细胞组分别将肝癌细胞HepG2、人视网膜色素上皮细胞、传代至第4代的神经干细胞和间充质干细胞接种于裸鼠皮下，于注射后12周进行解剖检查，观察裸鼠移植部位肿瘤形成情况。同时进行软琼脂克隆形成实验，考察神经干细胞和间充质干细胞在体外软琼脂克隆形成情况。

结果与结论：裸鼠致瘤性实验结果显示，空白组、阴性对照组、神经干细胞组、间充质干细胞组在接种12周后，未在裸鼠注射部位形成肿瘤，病理组织学检查未见异常。软琼脂克隆形成实验结果显示，神经干细胞和间充质干细胞在软琼脂阻力介质中未表现出细胞形成克隆的能力。提示短期传代后的神经干细胞、间充质干细胞不具有致瘤性。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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关键词: 干细胞, 神经干细胞, 间充质干细胞, 致瘤性, 克隆, 体内实验, 安全性

Abstract:

BACKGROUND:Stem cell tumorigenicity is a practical issue concerning stability in the clinical application of stem cells. Therefore, it is particularly important to clear whether stem cells have tumorigenic ability or not. Nude mice occupy an increasingly important position in oncology, immunology, and safety evaluation of drugs and biological products.

OBJECTIVE: To observe the tumorigenicity of neural stem cells and mesenchymal stem cells in Balb/c nude immunodeficient mice.

METHODS: Balb/c nude mice were randomly divided into control group, negative group, positive group, neural stem cell group and mesenchymal stem cell group. HepG-2 cells, RPE cells, passage 4 neural stem cells and mesenchymal stem cells were injected subcutaneously into nude mice from different groups, respectively. After 12 weeks of injection, anatomical observation was performed to detect the tumor formation in the transplantation site. Meanwhile, soft agar colony formation assay was applied to investigate neural stem cell and mesenchymal stem cell clone in vitro.

RESULTS AND CONCLUSION:After 12 weeks of injection, the tumorigenicity study results showed that no tumor developed in the transplantation site in the control group, negative group, neural stem cell group and mesenchymal stem cell group. Histopathologic examinations also showed no abnormality in these groups. Soft agar colony formation assay showed in soft agar resistance medium, neural stem cells and mesenchymal stem cells did not exhibit clone ability. These findings indicate that neural stem cells and mesenchymal stem cells undergoing short-term passages have no tumorigenic growth.

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Key words: stem cells, neural stem cells, mesenchymal stem cells, carcinogenicity tests, retinal pigment epithelium

中图分类号:

R394.2

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图/表（结果） 3

2.1 实验动物数量分析 实验选用Balb/c 裸鼠75只，分为5组，全部进入结果分析，无脱失。

2.2 裸鼠解剖学结果 空白组注射后在注射部位未见异常。阳性对照组注射后，裸鼠注射部位全部有小结节生长，并随着时间的延长结节体积逐渐变大；阳性对照组裸鼠在HepG-2注射后第7天开始形成肿瘤，注射1个月后，阳性对照组动物注射部位均有大小不一的瘤体生长，其肿瘤大小随着时间的延长，逐渐变大(图1)。

细胞注射后12周时大部分瘤体已经溃烂，且裸鼠体质量呈减少趋势，空白组、间充质干细胞组、神经干细胞组和阴性对照组在移植后12周对裸鼠的体质量并无明显影响(图2)。

神经干细胞组、间充质干细胞组注射3 d后，有部分裸鼠注射部位有小结节生长，注射1周后结节逐渐消失，至注射后12周内，该组动物注射部位均未见有瘤体生长。神经干细胞组注射后在12周内注射部位未见异常(图3)。

2.3 病理组织学结果 空白组、阴性对照组、神经干细胞组和间充质干细胞组12周后病理组织学检查注射部位未见异常。阳性对照组注射12周后，灶内细胞呈巢状或腺样排列，可见细胞分裂象，灶内大部分细胞变性、坏死(图4)。

2.4 软琼脂克隆形成实验镜下结果 阳性对照组在培养至5 d时，肉眼及镜下均可见有明显的集落形成；而空白组、阴性对照组、神经干细胞组和胚胎间充质干细胞组至培养期结束均未见有集落形成(图5)。

2.5 致瘤性检测结果 培养14 d后，阳性对照组的克隆形成率为3.3%，空白组、阴性对照组、神经干细胞组和间充质干细胞组中均未见有集落形成(图5)。

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引言

干细胞是一类具有自我更新和多向分化潜能的细胞群体，它能长期地自我更新，在特定的条件下具有分化形成多种终末细胞的能力。近年来对干细胞的研究与应用几乎涉及到所有生命科学和生物医学领域。因此，探讨干细胞临床前应用的安全性是有效开展干细胞治疗的前提。

目前临床研究上应用的干细胞以造血干细胞居多，对其特性、功能的研究及安全性评价的研究国内外已有较多报道。间充质干细胞是除造血干细胞外开展临床研究最多的干细胞类型，在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能^[1-10]。

神经干细胞是未分化的原始细胞，不表达成熟的细胞抗原，不被免疫系统识别，具有低免疫原性，主要来源于胎儿脑组织，由于受伦理限制，获得困难，研究证明通过自身骨髓或脐带血间充质干细胞诱导分化获得神经干细胞，因此是各种神经损伤的治疗的新的靶点细胞。在治疗脑瘫、脑梗死、脑出血的等脑病上发挥较好的改善作用^[11-18]。本实验将间充质干细胞和神经干细胞作为观察对象，来进一步评价其临床前安全性。

细胞的致瘤性检测一般采用动物体内接种法，可以根据细胞的特性及动物的敏感性选择动物的种类，国内及WHO建议可以采用裸鼠或经抗胸腺抗体处理过的新生小鼠，以一定的细胞量进行体内接种^[19-20]，检测细胞的致瘤性。

实验将神经干细胞和间充质干细胞进行体内裸鼠的致瘤性实验研究，旨在说明神经干细胞和间充质干细胞的移植对裸鼠致瘤性的影响，从而为干细胞安全性考察奠定实验基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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材料方法

设计：细胞学体外观察实验。

时间及地点：于2012年7月至2013年4月在中国医科大学四平医院吉林省组织工程研究重点实验室完成。

材料：

实验动物：雄性裸鼠，体质量17-19 g，无特定病原体(SPF)级胸腺缺陷Balb/c型，来源于上海斯莱克实验动物有限公司，动物质量合格证号：SXCK沪2012-0002。实验过程中对动物的处置符合2009年《Ethical issues in animal experimentation》相关动物伦理学标准的条例。饲料为吉林大学实验动物中心生产的⁶⁰Co辐照灭菌大小鼠全价颗粒饲料。垫料为吉林大学实验动物中心生产的⁶⁰Co辐照灭菌杨木刨花垫料。

实验方法：

实验分组：动物饲养于万级屏障环境的独立通气笼盒(IVC)笼内，由获得资格认可的动物管理人员饲养。室温19-25 ℃，湿度40%-70%，12 h照明，12 h黑暗；标准饲养盒内喂养，每盒2-4只。按照《中国药典》三部 (2010版) 要求进行^[21]，将裸鼠按随机数字表法分为空白组、阳性对照组、阴性对照组、间充质干细胞组、神经干细胞组，每组15只。

细胞处理方式为前肢右腋下皮下注射。空白组注射同批次细胞培养基，肝癌细胞(HepG2)阳性对照组每只裸鼠注射2×10⁷个细胞；人视网膜色素上皮细胞阴性对照组每只裸鼠注射2×10⁸个细胞；神经干细胞组每只裸鼠注射2×10⁷个细胞；间充质干细胞组每只裸鼠注射2×10⁸个细胞；给药体积为0.2 mL/只；给药次数为单次给药。分别于注射后21 d和12周对实验动物麻醉颈椎脱臼处死后，对注射部位进行大体解剖观察和病理组织学检查，观察肿瘤形成情况，每次雌雄各解剖7只动物。

实验所用脐带源间充质干细胞P3细胞分别进行了成骨、成脂诱导，诱导21 d后，分别使用茜素红染色检测钙盐的形成和油红O染色法检测脂滴。流式细胞仪结果表达CD75，CD90，CD105，不表达CD14，CD19，CD34，CD45和HLA-DR。神经干细胞免疫组化检测表达Nestin和Musashi，并可分化为神经元、星形胶质细胞，证实该细胞球具有增殖及分化的干细胞特性。

软琼脂克隆实验：按常规方法洗涤细胞、计数^[22]，制成细胞悬液即空白组、阳性对照组、阴性对照组、神经干细胞组、间充质干细胞组。将1.2%低熔点琼脂糖与2×培养基以1∶1的体积比混合制备0.6%底层琼脂。6孔板每个孔加入1.4 mL室温凝固，分别制备细胞悬液3×10⁷ L^-¹，1.5×10⁷ L^-¹，7.5×10⁶ L^-¹。将0.6%低熔点琼脂糖与2×培养基以1∶1的体积比混合，制备0.3%的上层琼脂，每孔加 1 mL上层琼脂和100 μL单细胞悬液，混匀，室温凝固。37 ℃细胞培养箱培养14 d，观察，计数。培养结束后，每孔中加入1 mL 0.005%结晶紫，染色至少1 h后，显微镜下观察，计数大于50个细胞的集落数，并计算细胞集落克隆率。

显微镜观察：培养结束后，每孔中加入0.5 mL 0.2%结晶紫，染色1 h后，显微镜下观察，计数大于10个细胞的集落数，并计算细胞集落克隆率。

细胞集落克隆率=平均细胞集落数/每孔中加入的细胞数×100%。

主要观察指标：①裸鼠干细胞移植部位病理组织学检查。②软琼脂克隆形成实验检测细胞集落克隆形成率。③裸鼠移植干细胞前后体质量及基本特征的变化。

统计学分析：以上实验均重复3次，统计结果以x(_)±s表示，应用PRISM 5.0统计软件，采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)对数据进行统计分析，以P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

干细胞是存在于胚胎和成体中的一类特殊细胞，它能长期地自我更新，在特定的条件下具有分化形成多种终末细胞的能力，不同来源的干细胞分化潜能各异^[23]。神经干细胞在胚胎或成年中枢神经系统内分布广泛，可以自我复制、并能够在一定的微环境中分化产生神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的一类多能干细胞^[24-25]。间充质干细胞来源于中胚层的成体干细胞，是造血微环境中的一种重要细胞成分，可以向多种组织及基质细胞增殖分化，而且免疫原性弱^[26-27]，在组织器官的损伤修复和重建、退行性疾病治疗及抗衰老领域得到广泛应用。目前，由于干细胞具有的多向分化潜能和自我更新能力使其成为未来再生医学的重要种子细胞，并成为研究人类早期胚层特化和器官形成、药物筛选以及基因治疗的最佳工具^[28-41]。因此，对干细胞的安全性评价是目前进行临床前研究所必须阐释的基本问题。

裸鼠在肿瘤学、免疫学、药品及生物制品的安全性评价领域占据愈来愈重要的地位。鉴于裸鼠先天性胸腺缺失，胸腺依赖性免疫功能缺乏，或T、B淋巴细胞功能完全缺乏，故异种移植时不产生排斥反应^[42-43]。同时，裸鼠皮下接种已知可致瘤(或癌)性细胞系的细胞悬液，在特定环境、特定时间可生长成实体瘤，能够保持原发瘤的组织学形态、免疫学特点及其特有的染色体组型。

本次实验将传至P4代的神经干细胞、间充质干细胞移植在Balb/c免疫缺陷裸鼠皮下，裸鼠移植后短时间内出现的细胞结节，可能与细胞移植数量较多，移植体积小有关，出现短时间内细胞较集中而无法被立刻吸收，出现结节。这种现象在移植5-7 d后，随着体内对干细胞的吸收，结节逐渐消失。经12周后病理组织学检查发现无异常，且与软琼脂克隆形成实验结果相一致。本次实验移植的神经干细胞数量为2×10⁷个/(0.2 mL•只)，间充质干细胞的移植数量为2×10⁸个/(0.2 mL•只)，较目前已发表的有关干细胞致瘤性的研究移植的细胞数量要高，增加了干细胞移植数量，就进一步加大了干细胞致瘤性的风险，通过本次实验验证，即使增加了移植细胞的数量也没有导致裸鼠成瘤性。此次实验为进一步考察间充质干细胞和神经干细胞的致瘤性研究奠定夯实基础。

实验证明，经过短期传代后的神经干细胞和间充质干细胞不具有致瘤性。